定义
莱茵伯格照明技术（Rheinberg Illumination）是一种光学染色技术。
照明原理
莱茵伯格照明技术最初是由英国显微镜学家朱利叶斯·莱茵伯格(Julius Rheinberg)于一百多年前向皇家显微镜学会和英格兰的Quekett俱乐部展示。该技术是使用彩色明胶或滤光片为暗场照明的样品和背景提供不同色彩，进而提高对比度。
莱茵伯格照明技术实际上可以看作是暗场照明的特殊变体[1]。在暗场显微镜中，布置下级聚光镜，使得从光源发出的穿过聚光镜的光线仅以非常倾斜的角度穿过样品。穿过聚光镜的光锥的中心区域被不透明的光阑挡住，光阑的直径足够大，可以防止光直接进入显微镜物镜。在更复杂的暗场聚光镜中，直接光的遮挡和倾斜光线的利用只能通过使用特殊设计的镜面来实现。
在暗场照明中，选择物镜的数值孔径（或通过物镜虹膜或物镜光阑来减小），以使来自聚光镜的光无法直接进入物镜[2]。当来自聚光镜的倾斜光线照射样品时，唯一会进入物镜的光是样品反射，折射或衍射的光。样品变得明亮而其他地方则较暗，故名“暗场照明”。黑色背景下而明亮物体的鲜明对比增加了细节的可见性。绿色的中央滤光片被不透明的光阑代替，而红色的倾斜照明滤光片被去除，使未过滤的白光通过时，暗场聚光镜的结构可以近似于图1中的插图。
在可与暗场类比的莱茵伯格照明（如图1所示）中，使用了几种类型和形状的滤光片。倾斜或外部光线通过宽视场的明场聚光镜后会穿过一种或多种颜色的环形（甜甜圈形）滤光片（在图2中显示为红色滤光器，在图3中显示为环形滤光器）；如图2中的几种组合所示，中心光线穿过另一个安装在环形滤光镜圆形开口中的圆形滤光镜。物镜一般会使用为全孔径物镜，在这种特殊情况下，标本会在绿色背景上显示为红色（图2（a）），在蓝色背景上显示为黄色（图2（b）），或者在红色背景上显示为绿色（图2（c））。莱茵伯格内径圆大小与物镜数值孔径相同，通过有颜色的内径圆透镜的直射光会使样品背景染上相同的颜色。由于外环透镜的半径大于数值孔径，所以只有经过样品折射、反射或者衍射的光束才能通过物镜成像，因此图像结果中样品部分被染上与外环滤片相同的颜色[3]。
莱茵伯格滤光片
1、莱茵伯格滤光片的样式
莱茵伯格滤光片可以用透明中心，环形彩色圆环的形式制备或制造，如图3所示，彩色环在中心具有圆形开口。在这些滤光片的商业版本中，附带有一组透明的彩色圆形滤光片或“中央滤光片”使其紧密贴合在环形圈的开口中（图4）。中央滤光片的直径可以通过增加将滤镜与外环分开的窄而黑的圆环的尺寸来改变（以调节背景照明强度）（图4（a-c））。有效的组合包括：红色环，紫色中央滤镜；橘黄色的环，蓝色中央滤镜等。通过使用带有彩色中央滤镜的透明无色环，可以产生其他视觉上有效的图像。例如，带有红色中央滤镜的透明环将在红色背景上产生白色或无色图像。
实际上，样本的颜色和外环颜色保持一致，背景的颜色则为中心滤光片的颜色。外圈也可以分成交替的颜色扇区，如图5所示。扇形滤光片在研究长宽尺寸以对比色显示的防翘曲材料，水晶面，硅藻和木质部分时特别有效。
2、莱茵伯格滤光片的制备
多年以来，一些显微镜制造商一直在销售带有彩色凝胶的莱茵伯格滤光片（类似于Kodak Wratten滤光片），这些滤光片已预先切割来适合其显微镜的次级滤光圆环。环形的外径为31-35毫米，中心滤光片的直径通常为15-18毫米，可与10x-0.25 NA的物镜配合使用。这些滤光片也可以使用柯达Wratten滤光片或那些可以使用科学设备供应商和光学组件分销商处广泛提供的彩色滤光片在实验室中方便地制备。明胶滤光片可以通过用合适直径的穿孔器切割中心滤光片来制备，而外环可以通过在滤纸上小心地画一个圆并用剪刀将其切出来制备。在实验室中可以通过构造黄铜模具来切割与Rheinberg滤光片架直径相同的环形滤光片。该模具可以快速从醋酸或明胶彩色滤光片上冲压出非常光滑的圆圈。环形滤光片的中心可以使用穿孔器切割。
有时，当滤光片均由非常薄的醋酸盐或明胶滤光片制成时，外部的环形滤光片很难为中心滤光片提供坚固的支撑。在这种情况下，可以只用双面胶带将中央滤镜用胶带粘在环形滤镜的中央，但是中心滤光片和环形滤光片的颜色会增加，因此请使用非常暗的滤光片作为中心滤光片。通常，中心滤光片应比环形滤镜暗得多，以使标本高光与背景形成鲜明对比。通常将两个或三个相同颜色的中央滤光片堆叠放置，以调整通过中央滤光片的光的透射率。Rheinberg滤光片也可以使用玻璃滤光片制造，当次级聚光镜有这些滤光片的支撑结构时，这将会非常方便。在这种情况下，最好将中心滤光片简单地粘在玻璃滤光片的中央。
照明效果及特点
使用图6中的鹿蜱（Ixodes dammini）的显微照片比较了明场，暗场和Rheinberg照明技术。第一张显微照片（a）显示了明场照明下的鹿蜱。图像缺乏对比度，许多细节难以解析。图6（b）显示了在暗场照明下的相同刻度，其中存在更多的对比度和细节，并且刻度上的许多特征都显而易见。使用蓝色中心滤光片和黄色环形环（参见图2（b））对鹿蜱进行莱茵伯格照明（图6（c）），引起增强的对比度效果，类似于暗场，而且具有比黑色背景更利于观察蓝色背景。在此示例中，暗场和Rheinberg照明技术产生的显微照片比明场要好得多。
在1930年代后期，卡尔·蔡司（Carl Zeiss）制造了一种特殊的聚光镜Mikropolychromar，用于产生美丽的Rheinberg图像。该聚光镜已经停产，现在几乎无法获得，但是它由一个非平面聚光镜组成，在其下方有三个单独控制的隔膜。最外面的光圈控制着视场的直径，两个较小的光圈控制着穿过中心盘的光。各种颜色的环形透明环是其中的一部分。相伴随的是一组透明的玻璃中心盘，它们整齐地装配在环形的中心开口中。一位作者（M. Abramowitz）已使用这种巧妙的聚光镜以各种放大倍数产生引人注目的显微照片，其中一些出现在出版物Omni，Time-Life，Scientific American和National Wildlife中。
莱茵伯格照明技术主要优势是通过将背景和目标物体用不同的颜色加以区分，可以提升图像的对比度，但是主要也存在一些问题，一是若满足所有倍率物镜的使用，则必须配备一整套不同半径的光学滤片，并且不同的样片所适合的颜色组合不同，因此若是获得对比度明显的彩色照明样品需要大量的滤片库，加上莱茵伯格光学滤片本身制作过程纷繁复杂，这大大增加了其使用成本。二是采用不同颜色的光学滤片实现彩色照明无法实现细微的线性调节，这使得系统无法细致的将样品与背景的对比调至最佳。受这上两点因素影响，莱茵伯格光学照明始终无法普及，导致至今也未有相应的商业化产品。
应用及条件
莱茵伯格照明适用于2倍至100倍的物镜。但是，为了清楚地区分内部和外部颜色，应在中心滤光片周围放置不透明的金属或纸环。例如，对于10倍物镜，不透明环的外径可能为15-18毫米，而对于60倍油浸物镜而言，不透明环的外径最好为22毫米。最好使用如图4所示的中心滤光片进行实验，以使用Rheinberg照明获得最佳结果。
在研究纤维，原生动物，纺织品，昆虫，木材切片，晶体或其他未染色的低对比度对象时，显微学家应考虑在其对比技术库中增加Rheinberg照明。之后可以查看和拍摄标本，从而产生视觉上增强且美观的图像。
参考文献
[1] 林飞. 基于可编程LCD的多功能显微成像系统的设计与实现[D].南京理工大学,2017.
[2] 林飞, 张闻文, 范瑶. 基于可编程LCD的莱茵伯格照明显微原理与系统设计[J]. 光学学报, 2016, 36(8).
[3] 魏宁. 基于斜照明的衬度增强技术研究[D]. 2015.
