定义
宽场荧光显微镜（Widefield Fluorescence Mircoscopy）是一种通过使用特定波长激励光激发样本中荧光体（Fluorophore），并通过目镜或相机接收荧光信号成像的技术。
这种技术可以对细胞群体、单个细胞结构和特定蛋白结构进行成像。因为可以同时对视场内的样本进行成像，所以宽场显微镜适合进行2D成像，同时可以具有很高的时间分辨率。因此，宽场显微镜可以用于活体细胞的动态成像，例如实时捕捉神经元中神经信号的传输过程。
荧光体
荧光体是一些特殊的分子，这些分子可以吸收特定波长的激励光，并辐射出荧光信号光，荧光信号光的波长比激励光波长更长。具体过程如图 1所示，荧光体在受到特定波长激励光照射时，荧光体分子中处于基态（Ground State）的核外电子会吸收激励光光子能量，并跃迁至高能级的激励态（Excited State）。部分处于高能级的荧光体分子核外电子首先会以非辐射跃迁的方式跃迁至亚稳态能级，随后以辐射跃迁的方式跃迁至基态，辐射跃迁过程中会辐射出对应能量波长的光子。这些辐射出的光子组成荧光信号光，被目镜或相机捕捉后用于荧光成像。
图 1 单光子荧光能级图
其中由于亚稳态能级的存在，荧光光子能量会比激励光光子能量低，即激励光波长比荧光波长短，两者的波长差称为斯托克斯位移（Stokes Shift），其示意图如图 2所示。在人眼识别范围（400nm~760nm）内，不同光的波长对应不同的颜色。特定荧光体对应特定激励光波长和荧光波长，所以同一样本中不同荧光体对应不同的激励光波长和荧光波长，即通过使用不同波长激励光照射样本，可以得到不同荧光体发出的荧光信号，以得到对于同一样本不同的荧光成像图，用于不同研究侧重点。
图 2 斯托克斯位移示意图
可以使用荧光体标记特定的生物组织样本。这些荧光体有些天然存在于各种生物组织中，例如叶绿体。也可以使用人工编辑基因代码的方式插入荧光体DNA，从而在生物组织中引入荧光体。亦可对生物组织引入被荧光体标记过的抗体，使生物组织可以产生荧光。现阶段常用的荧光体包括产生绿色荧光的绿色荧光蛋白，产生蓝色荧光的DAPI荧光体，产生红色荧光的德克萨斯红荧光体（Texas Red）。
宽场荧光显微镜工作原理
如图3所示为宽场显微镜光路图。由光源发出的激励光首先经过一个激励光滤波片（Filter），这个滤波片仅允许荧光体所需波长部分的激励光光通过，除去其他波段的杂波。经过输入滤波片后的激励光由二向色镜（Dichroic Mirror）反射进入物镜后聚焦于样本处。当激励光照射到样本后，荧光体会产生波长更长的荧光信号。一部分进入物镜的荧光信号会穿过二向色镜，再经过一个滤光片后，滤除含有的激励光杂波，将经过滤波后的荧光信号输入至目镜或相机并成像。在这个成像系统中，激励光和荧光均经过同一个物镜，称为“Epifluorescence”。系统中两个滤波片和二向色镜的作用是滤除各个光路中的杂波，提高荧光成像清晰度。
图 3 宽场显微镜光路示意图
现阶段在宽场荧光显微镜中最常用的光源是发光二极管（Light Emitted Diodes，LED），LED光源可以精确控制输出激励光的波长和强度，成本低，寿命长，产热低，结构紧凑，光路准直性要求低。这些特性使得LED成为宽场荧光显微镜中最常用的光源。相比之下，水银汞灯（Mercury arc-lamp）光源在一些给定波长具有更高的输出功率，但是使用寿命较短，在发光时会产生额外热量，输出强度较高更容易产生光漂白（Photobleaching）和光毒性（Photoxicity），同时还存在重金属泄露的风险。
成像时，可以通过目镜肉眼直接观察样本的荧光成像，也可使用相机进行图像采集。相机中的光电传感器由光电二极管阵列组成，这些光电二极管可以将光信号转换电流信号。最常用的两种光电传感器为CCD（Charge Coupled Devices）和CMOS（Complementary Metal Oxide Semiconductors），根据不同的帧率、噪声和灵敏度要求选择不同的光电传感器。
发展方向
宽场荧光显微镜可以产生较高分辨率的图像。但是，由于整个样本同时由激励光照射，所以存在如下问题。进行成像时某一样本处的深度分辨率受限，特别是当对厚度较高的样本进行成像时，无法分辨样品产生荧光的深度信息。这个特性使得宽场荧光显微镜不适用于3D样品荧光成像。使用多光子荧光成像（Multiphoton Mircoscope，MPM）、反卷积（Deconcolution）图像处理算法或结构光显微镜可以解决深度分辨率低的问题。如图 4所示，左图为使用宽场显微镜草履虫成像图，右图为经过反卷积图像处理后草履虫的成像图，对比观察可知，反卷积处理可以提高宽场显微镜成像分辨率。
图 4 宽场显微镜反卷积处理前后草履虫成像对比图
特点
宽场荧光显微镜具有成像速度快、分辨率较高、结构简单、成本相对较低的优点。但是未经改进的宽场显微镜不具有层析能力，无法对样本进行三维成像。
应用
宽场荧光显微镜可以用来探测细胞内特定结构。如图 5所示，为使用宽场荧光显微镜对纤维原细胞的成像图，图中绿色部分为使用Phalloidin染色的纤维状肌动蛋白，蓝色部分为细胞核DNA。
图 5 宽场荧光显微镜纤维原细胞成像图
参考文献
[1] Manz W , Arp G , Schumann-Kindel G , et al. Widefield deconvolution epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial arrangement of bacteria in sponge tissue[J]. Journal of Microbiological Methods, 2000, 40(2):125-134.
[2] Gustafsson M . Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(37):p. 13081-13086.
[3] Zipfel W R , Williams R M , Webb W W . Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences[J]. Nature Biotechnology, 2003, 21(11):1369-1377.
[4] https://www.scientifica.uk.com/learning-zone/widefield-fluorescence-microscopy
[5] https://ibidi.com/content/215-widefield-fluorescence
