定义
共聚焦显微镜是一种具有一定层析能力的高分辨率光学成像技术。
背景
共聚焦显微镜（CLSM）具有成像分辨率高、Z轴深度分辨率高这两个特点[1]。这意味着使用共聚焦显微镜可以对某一区域的生物组织样本进行图像显示，并通过不断调节Z轴深度，对一定Z轴深度范围内的生物组织进行成像，并通过叠加各个深度的二位成像，得到该区域生物组织的三维图像重构图。1957年，Marvin Minsky首先提出共聚焦显微镜这一概念，但是经过了很多年的发展才实现了完成显微镜所需的激光束扫描。经过不断地发展，最终实现了使用聚焦激光束对样品进行点对点扫描，完成二维图像重构，再到后期的三维成像。
传统显微镜进行成像时深度分辨率较差，而使用共聚焦显微镜可以对样品某一层进行成像，具有较高的深度分辨率，进而可以对样3本进行三维成像。
工作原理
1、原理概述：
如图1所示为共聚焦显微镜光路示意图，使用激光器发射出一束激光作为光源，输出的激光通过一个物镜聚焦在样品表面。通过改变激光束聚焦在样品的位置，实现激光聚焦点在样品一片区域内的扫描。产生的荧光信号经过一个小孔后，被光电探测器收集，小孔与焦平面处样本成共轭关系，离焦荧光信号被滤除，使得共聚焦显微镜具有一定层析能力。采集激光束扫描至每一点时激励光与样本反应产生的荧光信号，经过图像重构得到该片样本区域的荧光成像。
图 1 共聚焦显微镜光路示意图
2、原理详解：
如图2所示为共聚焦显微镜系统结构示意图[2]。在光源方面，共聚焦显微镜使用经过聚焦后的激光照射样本。光源激光器输出激励光经过衰光片（Excitation Filter）经行光强调节。
经过光强调节后的激励光进入一个由两个可快速精密调节角度反射镜组成的XY反射镜组。两个反射镜分别对应X轴Y轴方向，通过调节两个反射角度，使得经过XY反射镜组的出射激励光在一定面积的平面范围内按一定轨迹进行扫描。常见的扫描轨迹有栅格形（Raster）扫描轨迹、螺旋形（Spiral）扫描轨迹。
图 2 共聚焦显微镜系统结构图
XY反射镜组输出的扫描激励光传输到物镜的后方焦平面（Back Focal Plane），经过物镜（Objective）后的激励光会以焦点的形式随着XY反射镜组的工作在样本处进行扫描。
扫描过程中的入射激励光会与生物组织样本中的荧光物质相互作用产生荧光，一部分荧光会沿与入射激励光相反的方向在先后通过物镜和XY反射镜组后进入二向色镜（Beam Splitter）中，分光镜会反射激励光，同时不会反射信号光，起到分离激励光与荧光的作用。
经过分光镜后的荧光进入到物镜中再次被汇聚成为焦点，并在这个荧光焦点处加入针孔（Pinhole），此荧光焦点与样本处焦点具有对应关系，样本焦平面以外产生的荧光信号在经过针孔时会被遮挡住，因此仅有样本焦平面产生的荧光信号会通过针孔，针孔起到滤波作用，使得共聚焦显微镜具有深度辨析能力。
经过针孔后的荧光信号具有较强的层析能力，同时由于光强较弱，需要使用灵敏度较高的光电探测器进行探测。在此一般使用光电倍增管（Photomultiplier Tube，PMT）将荧光信号放大并转换为电信号，此电信号为模拟信号。光电倍增管可以在不引入噪声的情况下将微弱的光信号放大约一百万倍。光电探测器输出的电信号强度与输入荧光强度成正比。经光电倍增管转换成，与荧光强度成正比的电信号随后由模数转换器转换为数字信号，此数字信号对应样本焦点处荧光信号强度。随XY反射镜组扫描，通过探测特定深度样本区域内的荧光信号，得到每一点荧光强度对应的数字信号值，经过计算机图像处理将每一个数字信号值转换为对应的灰度值，每一灰度信号值对应一个像素点，将每个灰度信号与激励光扫描轨迹相对应得到成像图。
共聚焦显微镜组成部分
激光器（Laser）：根据样本中荧光体最敏感的波长，选择对应波长的激光器作为激励光光源。
二向色镜（Dichromatic）：二向色镜为一个滤光片（Filter），用于将荧光中掺杂的激励光分离出来，以便于荧光的后续处理。
XY扫描镜组（Scanner）：这是一个由一个或多个反射镜组成的镜组，用于引导聚焦后激励光焦点在样本上进行点对点（Pixel-by-pixel）和行对行（Line-to-line）的扫描。
物镜组：共聚焦显微镜的核心器件之一，用来调节成像系统的分辨率。
针孔（Pinhole）：用于提高共聚焦显微镜的层析能力。如图3所示为小孔滤除离焦荧光信号原理示意图[3]。图中方框代表样本，样本中双锥状区域为激励光光路，即发生荧光作用的样本区域，图中虚线所在平面的样本与小孔成共轭关系，可以通过小孔，其余所有离焦荧光信号均无法通过小孔。
图 3 针孔滤光示意图
电倍增管（Photomultiplier tube，PMT）：高度灵敏的光电探测器，将微弱光信号转换为电信号，方便后续的信号采集与数据处理。
特点
共聚焦激光扫描显微镜通过引入小孔，使得显微镜具有深度分辨率，成像质量增加。并且通过对体样本进行断层步进成像，通过后期图像处理可以得到体样本三维立体成像。
因为共聚焦显微镜为点扫描成像，所以其成像速度相对较慢。
应用
如图4所示，为使用共聚焦显微镜对葵花花粉进行5微米步进断层成像示意图，激励光为488nm（绿）和543nm（红）双波长配合激励，所得成像分辨率为3微米。通过将图 4中每一层的成像按顺序重组，可以得到如图5所示的葵花花粉三维成像图。
图 4 葵花花粉共聚焦显微镜断层成像图
图 5 葵花花粉共聚焦显微镜三维成像图
激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM)是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用红外光或可见光激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用[4]。
参考文献
[1] Cremer C , Cremer T . Considerations on a laser-scanning-microscope with high resolution and depth of field[J]. Microscopica Acta, 1978, 81(1).
[2] https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/microscope-resource/primer/techniques/confocal/confocalintro/
[3] https://www.leica-microsystems.com/science-lab/confocal-microscopy-optical-path/
[4] https://baike.baidu.com/item/激光扫描共聚焦显微镜/3833433
