定义
全内反射荧光显微镜是一种对位于玻璃/水或玻璃/样本交界面处荧光体分子进行成像的显微镜。
原理
全内反射是一种可以被用来观察不同折射率介质交界处样本的光学现象。如图1所示，光密介质n2中一束光以一定角度入射到光疏介质n1中，当入射角较小时，会同时产生进入到光疏介质中的折射光，和反射回光密介质中的反射光。当入射角大于一定角度时，会发生全反射，同时在光疏介质中会产生光强沿Z轴呈指数衰减的与入射光具有相同或频率的电磁场，这种电磁场称为倏逝波（Evanescent Wave）。
图 1 倏逝波产生示意图
式1：
式1中，n2为入射光所在介质折射率，n1为出射光所在介质折射率。当入射角大于
时会发生全反射。
全内反射荧光显微镜便是使用这种倏逝波对位于光导介质交界面处的样本进行照射，通过收集样本中荧光体（Fluorescent）与倏逝波通过荧光作用发出的荧光信号进行成像，照射深度一般为几百纳米。
全内反射荧光显微镜的特点便是倏逝波对于样本的浅穿透深度。因此，仅在光导介质交界面处附近样本中的荧光体会被倏逝波激励产生荧光信号，这使得全内反射荧光显微镜具有较强的层析能力。在倏逝场外产生的荧光强度非常低，因此成像信噪比高。
分类
如图2所示，根据全反射处结构的不同，分为棱镜（Prism）结构和物镜（Objective）结构两种种类。
图 2 全内反射荧光显微镜原理图（棱镜型、物镜型）
棱镜结构：在棱镜结构全内反射荧光显微镜中，入射光波在棱镜处以一定角度入射，在棱镜与盖玻片（Cover Slip）交界面处产生倏逝波，产生的倏逝波与位于盖玻片与物镜交界面处的样本进行荧光作用，产生的荧光信号由物镜收集并用于成像。棱镜结构全内反射荧光显微镜需要显微镜、棱镜、激光器光源这些常用的光学元件，因此这种结构相对便于实现。缺点是需要将所需观察的样本放置与显微镜物镜与棱镜中间，因此使用环境相对受限，应用较少。
物镜结构：这种结构的激励激光束由显微镜处产生，并经由物镜照射到样本上，一般采用大数值孔径的物镜。样本位于盖玻片之上。活体细胞样本的折射率一般在1.33~1.38之间。因此为了达到全内反射，要使用数值孔径大于样本折射率的物镜对这种样本进行照射。在实际使用时，一般选用数值孔径为1.77的物镜作为全内反射荧光显微镜的照射物镜。由于结构更为紧凑，物镜结构的全内反射荧光显微镜应用更为广泛。
全内反射荧光显微镜用于对位于光导介质交界面处的样本进行荧光成像，因此这只能对紧贴于交界面处的样本进行成像，无法对远离交界面处的样本进行成像。为了保证成像的顺利进行，需要提高样本对于交界面的依附性。同时还需保证样本的折射率低于物镜的折射率。
特点
与共聚焦显微镜相比，全内反射荧光显微镜适合观测100nm深度的样本。其激励光照射深度限制在交界面处，从而降低样本光损伤。
另一方面，由于不需要振镜（Galvanometer）进行扫描成像，全内反射荧光显微镜成本相对较低。可以广泛应用于各类实验室中。
棱镜型和物镜型全内反射荧光显微镜各自特点如下[3]：
棱镜型：
- 入射光线的可以以更大的入射角对样本进行照射，进而可以对折射率相对较低的光密介质样本进行成像。
- 全反射产生倏逝波相对于物镜型全内反射荧光显微镜更纯净，杂波相对较少。
- 棱镜型全内反射荧光显微镜系统结构相对简单，易于搭建。
- 入射激励光在棱镜底部光导介质交界面处的尺寸即为成像视场。
物镜型：
- 物镜型全内反射荧光显微镜入射光束需要穿过高NA物镜边缘。
- 物镜NA越高，成像层析能力越强。
- 光照明强度相对较低。
- 物镜内光散射严重。
物镜型全内反射荧光显微镜产生的倏逝波不如棱镜型纯净，杂波相对较多。
应用
全内反射荧光显微镜的应用主要集中在单分子检测（如细胞受体）、胞吐或内吞的成像、微管粘附灶的测量以及特定离子通道的定位、活性和结构等研究。
如图3所示为使用物镜型全内反射荧光显微镜对宫颈癌细胞的成像图。成像实验中，使用18mm直径，1.78折射率的盖玻片固定宫颈癌细胞样本，并使用若丹明（Rhodaming）红色荧光染料对癌细胞样本进行染色，并使癌细胞处于1.78折射率环境中。选用1.65NA的物镜进行全内反射成像。
图 3 棱镜型全内反射荧光显微镜宫颈癌细胞成像图
参考文献
[1] Axelrod D . Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy in Cell Biology[J]. Traffic, 2001, 2.
[2] Schneckenburger H . Total internal reflection fluorescence microscopy: technical innovations and novel applications[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2005, 16(1):13-18.
[3] Fish K N . Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy[M]// Current Protocols in Cytometry. John Wiley & Sons, Inc. 2009.
