钙离子是生物体内最重要的信号信使之一，参与肌细胞收缩、腺细胞分泌、神经递质释放、细胞增殖、分化和凋亡等过程。钙离子成像技术（Calcium imaging）是指利用钙离子指示剂监测细胞内钙离子浓度的方法。钙离子成像技术能直接测量神经元中动态的钙流动，从而判断神经元的活动，被广泛应用于神经科学的研究。
钙离子成像技术的原理
在哺乳动物的神经系统中，钙信号与神经细胞的兴奋性、细胞通讯、递质释放、突触可塑性以及基因转录等诸多生理、病理过程相关。当神经元膜电位发生去极化，产生的动作电位传导到神经元轴突末梢时，细胞膜上的电压门控钙离子通道打开，大量钙离子内流，包含神经递质的囊泡由突触前膜释放至后膜，下游神经元就得以接受到上游的信号（图1）。因此，钙离子浓度可以表征突触传递和神经元活动。
图 1 神经元激活的分子过程示意图[1]
神经元钙离子成像技术的原理就是借助钙离子浓度与神经元活动之间的对应关系，利用特殊的荧光染料或蛋白质荧光探针，将钙离子浓度通过荧光强度表示出来，并被显微镜捕捉，从而达到监测神经元活动的目的。
钙离子指示剂
钙离子成像技术需要根据实验要求选择合适的钙离子指示剂。目前，广泛使用的钙离子指示剂有化学性钙离子指示剂（Chemical Indicators）和基因编码钙离子指示剂（Genetically encoded calcium indicators，GECIs）两类。
化学性钙离子指示剂
这类指示剂大都是基于钙螯合剂EGTA（乙二醇双四乙酸）或BAPTA（氨基苯乙烷四乙酸）修饰而成，与钙离子有较高的亲和力和较快的结合速度，而不会和镁离子螯合。根据测光原理和所得数据的性质，可分为比值型和非比值型。比值型钙离子指示剂有Indo-1、Fura-2等，非比值型钙离子指示剂有Fluo-3、Fluo-4和Oregon Green 488 BAPTA等。表1列出了一些常见的化学性钙离子指示剂。
表1 常见的化学性钙离子指示剂
| 指示剂 | 激发/发射波长（nm） | Ca2+ Kd（nM） |
| Fura-2 | 340/380 ex, 510 em | 224 |
| Indo 1 | 338 ex, 405/488 em | 230 |
| Fluo-3 | 503 ex, 530 em | 400 |
| Fluo-4 | 503 ex, 530 em | 345 |
| Fura Red | 436/472 ex, 637/657 em | 140 |
| Rhod-2 | 550 ex, 576 em | 1mM |
| X-rhod-1 | 580 ex, 602 em | 700 |
| Calcium Green-1 | 506 ex, 532 em | 190 |
| Calcium Orange | 549 ex, 576 em | 185 |
| Oregon Green 488 BAPTA | 494 ex, 523 em | 170 |
例如，Fura-2是常用的比值型钙离子指示剂（图2）。低钙浓度下，Fura-2在~380nm处激发，高钙浓度下，在~340nm处激发，而发射峰（510nm）没有明显变化。通过340/380nm交替激发，获取在510nm处对应的发射光荧光强度的比率，就可以对钙浓度进行定量测量。与Fura-2不同，另一比值型钙离子指示剂Indo-1，在340nm处用单一波长激发，在400nm和480nm处分别检测结合和未结合钙的荧光信号，通过二者的比率确定钙浓度。比值型钙离子指示剂的数据形式采取比例的方式，不受实验设备、指示剂的负载浓度、细胞的环境变化等影响，结果准确性高。
图 2 经典化学性钙离子指示剂Fura-2的结构及作用原理[2]
非比值型钙离子指示剂的特点是指示剂在结合钙后发生发射光强度的变化。例如，Fluo-3是典型的的单波长指示剂，最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。它与钙结合之前几乎无荧光，结合后荧光强度会增强100倍以上。Fluo-4是Fluo-3的升级版，其荧光光谱特性、与钙的亲和力与Fluo-3相似，在相同钙浓度下其荧光强度更强。Oregon Green 488 BAPTA对钙的亲和力较高，有利于检测几乎静止状态下钙含量的微小变化。此外，Oregon Green 488 BAPTA吸收双光子激发比其它的荧光钙指示剂效率更高。非比值型钙离子指示剂多为可见光激发，具有更强的染料吸收性能，对钙变化检测更敏感，能够降低对活细胞的光毒性和样品自发荧光以及光散射的干扰。
基因编码钙离子指示剂
根据发光原理可将GECIs分为两大类：基于荧光共振能量转移(Fluorescent resonance energy transfer，FRET)的GECI和单荧光基团GECI，如图3所示。前者包括Cameleons、TN-XXL等，后者包括GCaMP、Pericams等。对于FRET-based GECI，当不存在钙离子时，在440nm的激发波长下，ECFP产生蓝色荧光，Venus不产生荧光；而钙离子存在时，钙离子与钙调蛋白CaM结合，在440nm激发波长下ECFP发生能量共振转移至Venus，最终产生黄色荧光；对于单荧光基团GECI，钙离子浓度上升导致钙调蛋白CaM与M13结合，引起EGFP构象改变，发出绿色荧光。
图 3 基于FRET的GECI和单荧光基团GECI作用原理示意图[2]
GCaMP是目前最常用的GECI类型之一，它是以单个荧光蛋白为基础构建而成，其突出优势是可以通过特异的启动子和定位序列实现在特定类型细胞或亚细胞结构表达。GCaMP经历了各种迭代，变得更亮、更快、更稳定、毒性更低，其中GCaMP6由于其超强的敏感度，被广泛应用于活体钙成像研究。GCaMP6有GCaMP6s (slow)，6m (medium)，6f (fast)三种亚型，可根据实验需求选择，GCaMP6s高敏感，适合低频信号的指示，GCaMP6f有快速动力学曲线，解离最快，适合高频信号的指示（图4）。
图 4 几种不同GCaMP的特性[3]
钙离子成像技术的应用
借助钙离子成像技术，研究人员可以记录培养神经元、脑片神经元及活体神经元的活动。得益于双光子荧光显微镜的发展，活体动物钙离子成像技术取得飞速发展。除了记录活体神经元的高度同步网络活动，研究人员也能记录单个树突棘钙信号。同时，钙离子成像技术还能与行为学结合，研究动物不同行为状态下的神经元反应。例如，钙离子成像技术揭示神经元如何处理来自外界的信号，如气味。Komiyama等人用双光子显微镜观察活体小鼠运动皮层神经元在嗅觉选择任务中的神经元活动[4]。图5展示了运动皮层相关的嗅觉判断实验，动物被训练后，当嗅到A气味时做出“舔”的动作，嗅到B气味时停止“舔”。神经元细胞的钙离子瞬时变化在运动皮层中被记录。
图 5 在嗅觉相关选择行为中，头部固定小鼠运动皮层的钙成像[4]
然而，这些实验需要对动物进行头部固定，动物在实验期间处于物理约束和情绪压力下，无法证明其神经元活动与自由运动下是等价的，因此，神经科学家更希望能够对自由活动的动物进行研究。微型化双光子荧光显微镜的出现，使得研究人员可以进行自由行为动物的钙成像。超维景公司的高速高分辨微型化双光子显微成像系统（FHIRM-TPM），采用精密的光学成像设计，能够对目前广泛使用的钙离子指示剂如GCaMP6的有效激发，实现自由行为动物树突棘水平神经活动的稳定实时观察（图6）。
图 6 小鼠（GCaMP6s病毒注射）跳跃时的神经元活动
结语
钙离子成像技术的诞生，让每一个细胞的活动都变得可视化，在宏观和微观世界之间架起了桥梁。对细胞钙变化的监测可以有效地研究钙依赖的生理过程、细胞自身的钙信号以及神经活动等。借助双光子显微镜，钙成像能在活体条件下对不同类型细胞中钙变化的时空动力学进行测量，因此成为解析脑各种功能活动的强有力工具。
参考文献
[1] Wang, W., C.K. Kim, and A.Y. Ting Molecular tools for imaging and recording neuronal activity. Nature Chemical Biology, 2019. 15(2): p. 101-110.
[2] Grienberger, C. and A. Konnerth Imaging Calcium in Neurons. Neuron, 2012. 73(5): p. 862-885.
[3] Chen, T.W.et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature, 2013. 499(7458): p. 295-300.
[4] Komiyama, T.et al. Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice. Nature, 2010. 464(7292): p. 1182-1186.
