文章名称：An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy
发表期刊：Nature Methods
发表日期：2020年2月
1 背景
脑研究一直是生命科学研究领域的重要课题，对脑功能的理解需要借助对脑内神经元活动进行记录来完成。光学成像以其高分辨率、高成像速度、非侵入式成像的特点成为脑研究的主要研究手段之一，而多光子显微成像（Multi-photon microscopy , MPM）技术则是目前最主要的成像手段。
多光子显微成像技术基于荧光显微成像理论，利用多光子技术激发生物样本荧光，与光学成像方法相结合，达到成像的目的。对于脑成像来说，因为要动态记录神经元活动，成像分辨率、速度、深度，都是需要考虑的指标。
典型的MPM都在光子散粒噪声极限下工作，在高时空分辨率下可以成像的神经元数量受到生物样本中最大允许平均功率和峰值功率的限制。提升扫描速度，扫描尽可能多的神经元数目并不能解决这一问题，因为对于神经元活动来说，必须需要一定数量的信号光子，才能以一定的置信程度进行量化。而提升激光功率则有可能对生物组织造成损伤，甚至造成脑死亡。这使得如何在现有功率水平和显微镜成像技术下，提高成像神经元数量，成为了一个难题。
Bo Li（李博）和Chris Xu于2019年12月2日在Nature Methods杂志上发表的文章“An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy”，针对上述问题给出了解决方案。通过这种方案，可以在不增加平均功率和峰值功率的情况下，提升成像速度，并将可记录的神经元数量提升至30倍以上。
2 研究结果
在实际进行脑成像的过程中，我们往往是对脑内某一区域的神经元活动进行观察和记录。例如对小鼠大脑皮层的成像，神经元区域相对整个脑皮层来说，只占据了其中的10%以下。在对整个样本进行扫描的过程中，实际上很多无用的信息也被纳入了其中。如果我们对样本的扫描只集中于实际所需要的部分(Region of interest, ROI)，使激光光源只在扫描到ROI时开启。研究人员通过这种方式，实现了自适应的激光光源（Adaptive excitation source, AES）。具体的工作原理见图1。
图 1 AES工作原理
如图1所示，激光光源首先将周期性的激光信号用于扫描整个样本范围，获得整体的图像，之后对图像进行处理对信息进行过滤，找到相应的ROI，结合反馈回来的激光光强信息，来对激光源的输出信号进行调控，使得激光光源仅在ROI内保持开启，所得激光信号形式见图2。
(a)未经处理的周期性激光输出信号
(b)根据图像ROI信息进行处理过的激光输出信号
图 2 激光源输出信号对比
当对样本的扫描经过ROI时，激光源打开，而扫描到非ROI区域时，激光源保持关闭。为了实现这种激光源的触发形式，需要激光源的触发和扫描进行同步，使得在扫描到ROI时，信号光子能够得到有效的触发。同时，因为这种方式下激光信号并非周期形式，激光的触发是瞬态的，激光的光功率会发生波动，对信号光子的激发和成像效果造成影响。为了补偿这种波动，作者采用了闭环补偿(Automatic feedback loop)的思想，利用光电二极管反馈输出激光的强度，来对输出激光强度进行调控，消除瞬态波动，得到更好的成像效果。
作者利用AES进行了双光子和三光子的成像实验，成像结果见图3。双光子成像实验的成像深度为小鼠脑膜下680 μm，视场大小为700 μm × 700 μm，帧率30 Hz，每帧512x521像素。三光子成像试验的成像深度为小鼠脑膜下750 μm，视场大小为620 μm × 620 μm，帧率30 Hz，每帧512x521像素。
（a）双光子成像结果
（b）三光子成像结果
图 3 未使用（左）与使用AES（右）成像结果对比
通过对比成像结果，在双光子成像实验中，使用AES情况下相同神经元所激发出的信号光子数目相比于未使用AES提高了7倍，而平均功率降低了4.5倍。而在三光子成像实验中，在相同的激光平均功率下，使用AES会比未使用AES所获得的信号光子数目提高30倍。通过实验的对比，充分证明了使用AES进行多光子成像实验的有效性，它对于提高信号光子数量，获得更佳的成像效果有着显著的帮助。
除此之外，因为AES的自适应是基于图像的ROI来实现，它的实现并不需要对显微镜的硬件进行任何修改，这使得它可以与任意一款多光子显微镜结合进行成像实验，应用于更广泛的成像领域，而不仅仅局限于脑成像范畴。这不但使得脑科学的研究手段有了极大的提升，也使得MPM成像技术上升到了新的高度。
3 小结
研究人员开发了一种自适应飞秒激发光源，该激发光源仅照亮感兴趣的区域，将双光子和三光子的光功率降低了30倍，从而在不损伤大脑的情况下，提高成像速度、增大视场、增加成像深度和降低了激光器的成本。
参考文献
Li B, Wu C, Wang M, Charan K, Xu C. An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy. Nat Methods. 2020;17(2):163-166.
