文章名称：Rapid volumetric imaging with Bessel-Beam three-photon microscopy
发表期刊：Biomedical Optics Express
发表日期：2018年4月
1 摘要
多光子荧光显微镜可对体内深层组织进行高分辨率、无创成像。最近发展的三光子显微镜（3PM）可将小鼠脑的成像深度扩展到1.0 mm以上。但是由于三光子显微镜使用的激光器重频较低，其成像速度受限。为了提高3PM的体成像速度，我们使用贝塞尔光束与三光子组合激发（3PE）成像，并且在理论和实验上证明了贝塞尔光束3PM具有更高的信噪比（SBR）。最后，我们对活体果蝇和老鼠大脑神经元等结构区域进行贝塞尔三光子成像。这些结果表明使用贝塞尔三光子成像具有更快的体成像速度以及信噪比。
2 背景
多光子显微镜（MPM）凭借其高分辨率、成像深度深等特性，在细胞生物学和神经科学研究中发挥重要作用。受益于高阶非线性的激发和更长的激发波长，3PM成像的信噪比优于双光子显微镜（2PM），可对小鼠脑组织进行非侵入性的功能成像，成像深度超过1 mm。使用3PM，可记录海马锥体上层的自发神经活动。
有多个因素会降低MPM的成像速度：（1）MPM使用飞秒激光脉冲激发样品，激发仅限于物镜焦点附近，所以必须对样本进行逐像素扫描以获得3D图像；（2）进行轴向扫描时物镜的机械运动会降低成像速率；（3）三光子使用的飞秒激光的低重频率（1-2 MHz），也限制了其成像速度。
人们提出了多种方法用于优化三光子显微镜的成像速度。包括使用空间光调制器SLM进行波前整形，使用声光调制器进行随机扫描等。对于稀疏标记的样品，也可使用贝塞尔光束对其进行3D体积成像。贝塞尔光束具有轴向延展的，针状的光强度分布，并在扩展的景深范围内保持相同的横向分辨率，所以可以产生3D样本在2D维度的投影。考虑到单个神经元通常具有在3D体积稀疏分布的树突结构，贝塞尔光束扫描是一种出色的快速成像方法，用于获取神经元结构和活动的信息。由于使用贝塞尔三光子获得的图像是样本在2D维度上的投影，无法提供z轴的深度信息。因此，我们可以使用Bessel-3PM获得不同深度上的时间信息，并使用点扫描3PM作为辅助，获取成像的深度。 尽管如此，样本必须稀疏标记。否则，如果轴向信息过多，该方法将由于信息过量堆叠而降低成像质量。
贝塞尔光束已被用于双光子显微成像。然而，零阶贝塞尔光束横向平面上的强度分布在双光子激发下具有较强的旁瓣，会降低成像的信噪比。三光子激发属于三阶的非线性效应，旁瓣比双光子激发小得多。 在本文中，我们分别使用920 nm和1300 nm的飞秒激光对贝塞尔双光子和贝塞尔三光进行分析，结果证明了贝塞尔三光在斑马鱼幼虫，果蝇和活体小鼠脑区成像具有优异的信噪比。
3 方法和材料
具有贝塞尔光束或高斯光束的三光子和二光子成像系统如下图所示：
图 1 光学系统的结构
F1为分光片，用于区分1300 nm激光和930 nm激光。使用轴锥生成贝塞尔光束。GMX为扫描振镜，用于扫描光束。如果读者想了解具体的实验器件型号，请参考原文，此处不再做赘述。
4 结果
图2（a）、（b）为贝塞尔三光子、贝塞尔双光子x,z平面理论上的点扩散函数图。图2（c）、（d）为贝塞尔三光子、 贝塞尔双光子x,z平面点扩散函数的实验结果。理论与实验结果吻合。
图2（e）、（g）为理论贝塞尔三光子、 贝塞尔双光子x,y平面光强分布。三光子荧光二阶瓣膜的理论强度是中心强度的5.3%, 双光子荧光二阶、三阶、四阶瓣膜的理论强度分别是中心强度的27.2%、15.2%、10.6%。贝塞尔双光子光束旁瓣产生的荧光显著降低图像的信噪比。
图2（f）、（h）为实验测得贝塞尔三光子、贝塞尔双光子x,y平面光强分布。三光子荧光二阶瓣膜的理论强度是中心强度的5.1%，双光子荧光二阶、三阶、四阶瓣膜的理论强度分别是是中心强度的27.8%、14.6%、10.1%。理论与实验结果吻合。
图2（i-l）使用贝塞尔三光子和贝塞尔双光子对活体斑马鱼的血管进行成像。图2（i）为贝塞尔三光子和贝塞尔双双子的对比成像。对于贝塞尔三光子，物镜出射光强为90 mW（在1300 nm）；对于贝塞尔双光子，物镜出射光强为127 mW（在920 nm）。使用贝塞尔三光子获得的图像比使用贝塞尔双光子更清晰。
图 2 理论模拟和实验测量的点扩散函数
对小鼠体内的3D神经元结构进行成像，贝塞尔三光子与三光子点扫描的成像结果如图3（a）、（b）所示。图3（a）为使用贝塞尔三光子对小鼠神经元从620 μm到685 μm深度进行的体成像结果，成像速度为1 Hz（512 × 512像素/帧），体积为300 μm × 300 μm × 65 μm。图3（b）为使用3PM点扫描的成像结果，成像速度1 min。这些成像结果凸显贝塞尔三光子在体内深层大脑中进行稀疏标记体成像的优势。
此外，作者还开展了对果蝇神经元进行成像的相关实验，此处不再赘述，读者若感兴趣，可查阅原文进行阅读。
图 3 Thy1-YFP转基因小鼠神经皮层的三光子在体成像
5 小结
在这项工作中，我们介绍了基于轴向拉长的贝塞尔光束双光子、三光子成像方法，并对斑马鱼幼虫，果蝇和小鼠进行相关成像。我们的方法可以在5 Hz扫描速度下进行500 μm × 500 μm × 300 μm的体积扫描。贝塞尔三光子在穿透深度、信噪比和成像速度方面均具有卓越的性能，并有可能提供一种新的多光子成像工具来研究体内三维神经回路内的信息加工。
参考文献
Chen, B. et al. Rapid volumetric imaging with Bessel-Beam three-photon microscopy Biomedical Optics Express, 2018. 9(4): p. 1992-2000.
